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Rosiglitazona modula la respuesta inmune innata a la infección por Plasmodium falciparum y mejora el resultado en Experimental malaria cerebral Lena Serghides 1. 2. Samir N. Patel 2. 3. Kodjo Ayi 2. 3. Ziyue Lu 2. D. Channe Gowda 4. W. Conrad Liles 1. 2. 3 y Kevin C. Kain 1. 2. 3 1 Unidad de Enfermedades Tropicales de la División de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Medicina, Hospital General de Toronto, 2 McLaughlin-Rotman Centro para la Salud Global, Centro McLaughlin para la Medicina Molecular, Hospital Universitario de Salud Red-General de Toronto, y 3 Facultad de Medicina de la Universidad de Toronto, Toronto, Canadá; 4 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad Estatal de Pensilvania, Hershey, Pensilvania Reimpresiones o correspondencia: Dr. Kevin C. Kain, Hospital General de Toronto, ES 13-214, 200 Elizabeth St. Toronto, Canadá M5G 2C4 (kevin. kain@uhn. on. ca) Abstracto Para los síndromes de malaria graves, tales como la malaria cerebral, los resultados clínicos adversos a menudo son mediadas por el sistema inmune en lugar de causadas por el parásito directamente. Sin embargo, pocos agentes terapéuticos se han desarrollado para modular las respuestas inmunopatológicas del huésped a la infección. En este caso, nos informan de que el proliferador de peroxisomas activado γ del receptor (PPAR) rosiglitazona agonista modula la respuesta del huésped a la malaria mediante la mejora de aclaramiento de fagocitosis de los eritrocitos malaria parasitados y por la disminución de la respuesta inflamatoria a la infección a través de la inhibición de Plasmodium falciparum activación glicosilfosfatidilinositol inducida de la la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) y el factor nuclear-kB (NF-kB) vías de señalización. Se encontró que, en la cepa ANKA modelo experimental Plasmodium berghei de la malaria cerebral, la rosiglitazona modificó la respuesta inflamatoria a la infección de la malaria y la mejora de la tasa de supervivencia incluso cuando se inició tan tarde como el día 5 después de la infección tratamiento. Además, rosiglitazona redujo la parasitemia de una manera dependiente de CD36 en el modelo de Plasmodium chabaudi chabaudi hiperparasitemia. Estos datos sugieren que los agonistas de PPAR representan una nueva clase de fármacos inmunomoduladores anfitrión que puede ser útil para el tratamiento de síndromes de malaria grave El paludismo por Plasmodium falciparum es un determinante importante de la tasa de mortalidad infantil, causando un estimado de 1-3 millones de muertes al año [1. 2]. La malaria cerebral es una de las complicaciones más letales de la infección por P. falciparum y afecta a unos 785.000 niños africanos cada año [1. 2]. No hay un tratamiento específico para la malaria cerebral, ya pesar de la utilización de la terapia antimalárica rápidamente activo, tal como la quinina parenteral o artesunato, las tasas de mortalidad siguen siendo elevados [3 -5]. Esto puede ser atribuible a la observación de que las intervenciones para la malaria son antiparasitario, a pesar de los malos resultados asociados con la malaria cerebral parecen estar mediados por más respuestas inmunopatológicas del huésped a la infección por el parásito de por sí [3 -6] Eventos clave en la patogénesis de la malaria grave y cerebral incluyen el secuestro de eritrocitos parasitados dentro de la microvasculatura cerebral; respuestas inflamatoria mal regulada a la infección, lo que contribuye a la lesión tisular mediada inmunológicamente, la activación endotelial y la regulación positiva de los receptores de secuestro; y las altas cargas parasitarias que mejoran aún más el secuestro de parásito y las respuestas inmunopatológicas [7]. La definición de los mecanismos que subyacen a la respuesta del huésped a la malaria pueden identificar nuevos objetivos para la inmunomodulación e intervenciones para mejorar el pronóstico de las personas con síndromes de malaria grave víctimas mortales asociados a la malaria se producen predominantemente entre los individuos que no son inmunes a la infección por Plasmodium. La supervivencia de los seres humanos infectados y en modelos murinos de malaria parece estar vinculado críticamente a la capacidad del huésped para contener la replicación de los parásitos en fase de sangre durante la fase aguda de la infección [6]. Debido a que la respuesta inmune específica por malaria son en gran parte ausente durante la infección aguda por Plasmodium, mecanismos innatos parecen ser esenciales en el control de la replicación del parásito y en la disminución del riesgo de progresión a enfermedad grave y fatal. Por consiguiente, la respuesta inmune innata representa un objetivo atractivo para la intervención terapéutica [6] fagocitos mononucleares representan una primera línea de defensa esencial innata contra la malaria [6. 8 -12]. Los receptores de reconocimiento de patrones de macrófagos, incluyendo los receptores tipo Toll (TLRs) y los receptores scavenger tales como CD36, son componentes importantes en la regulación de la respuesta inmune [13. 14]. receptores de reconocimiento de patrones detectar una amplia gama de moléculas microbianas y activan respuestas proinflamatorias a la infección. Los parásitos y productos de parásitos, tales como glicosilfosfatidilinositol P. falciparum (PF GPI) y hemozoin más ADN del parásito, inducen la liberación de citoquinas proinflamatorias a través de la interacción con los receptores de reconocimiento de patrones, incluyendo TLR2, TLR9 y CD36 [11. 15 -22]. Los macrófagos en general [6. 9. 10] y de macrófagos CD36, en particular, se ha demostrado que median la eliminación de los eritrocitos parasitados y, en modelos experimentales de malaria, para ayudar a la replicación del control de parásitos en etapa de sangre durante la infección aguda y para mejorar la supervivencia del huésped [6. 11. 19 -21] Sobre la base de estas observaciones, la hipótesis de que la modulación farmacológica de la inmunidad innata a través de vías de participación de CD36 y receptores de reconocimiento de patrones relacionados podría incrementar la eliminación del parásito, modificar respuestas inflamatorias huésped perjudicial a la infección, y mejorar el resultado. transcripción CD36 está regulada por el receptor nuclear heterodímero peroxisoma proliferador activado del receptor γ-retinoico receptor X (PPAR-RXR) [23]. PPAR-RXR se activa cuando cualquiera de las partes es obligado ligando, y regula la transcripción de una variedad de genes, incluyendo los que codifican los receptores de reconocimiento de patrones [23. 24]. agonistas de PPAR también se han demostrado para modular las respuestas inflamatorias, incluyendo disminución de la secreción de citoquinas proinflamatorias a través de la inhibición de la actividad de factores de transcripción, tales como activador de la proteína-1 (AP-1) y el factor-kB (NF-kB) [25 nuclear - 28]. Hemos postulado que la Administración de Drogas (FDA) de los Estados Unidos de Alimentos y - aprobada agonistas PPAR podría, a través de su potencial para mejorar la eliminación del parásito y regular la respuesta inflamatoria a la infección, servir como agentes inmunomoduladores para el tratamiento de la malaria. Aquí, demostramos in vitro y en 2 modelos complementarios in vivo que la rosiglitazona, un agonista PPAR [29], el despacho de fagocitosis mejorada de parásitos, regula las respuestas inflamatorias a la infección, y, en un modelo experimental de la malaria cerebral fatal, mejora de la supervivencia métodos Los cultivos de los parásitos del clon de laboratorio de P. falciparum ITG, mantenidos y sincronizados como se describe en otro lugar [19. 20], se trataron con un agente de eliminación de micoplasma (ICN). Todos los cultivos fueron negativos para micoplasma mediante análisis de reacción en cadena de la polimerasa antes de su uso. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo, en alícuotas y se congelaron para su posterior uso. cepa Plasmodium berghei ANKA (PBA; Centro de Recursos para la malaria) y Plasmodium cepa chabaudi en ratones (PccAS; proporcionado por el Dr. M. Stevenson [McGill University, Montreal, Canadá]) se mantuvieron por el paso regular en ratones ingenuos ensayos de fagocitosis ensayos de fagocitosis se realizaron como se describe en otro lugar [19 -21] (véase también los métodos complementarios en el apéndice, que no está disponible en la edición impresa del Diario apéndice, que sólo aparece en la edición electrónica de la revista). Un total de 1 × 10 6 células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) o 2 × 10 5 macrófagos murinos se sembraron y se trató durante 48 h con rosiglitazona o con sulfóxido de dimetilo (DMSO) como control. Fragmento cristalizable (Fc) regiones (concentración, 20 mg / ml) se utilizaron para bloquear los receptores de Fc. Se han usado cuando sea apropiado diversos anticuerpos monoclonales (concentración, 5 mg / ml). parásitos sincronizados fueron capas en la parte superior de una relación final de 10 eritrocitos parasitados a 1 de monocitos. lisis hipotónica se utiliza para eliminar los eritrocitos parasitados nonphagocytosed. La fagocitosis se cuantificó microscópicamente contando el número total de eritrocitos parasitados observado en 500 monocitos / macrófagos La detección de la expresión de superficie CD36 por citometría de flujo Los macrófagos se trataron durante 48 h con rosiglitazona o con DMSO como control, y la expresión en superficie de CD36 se detectó por tinción de los macrófagos con anticuerpos monoclonales anti-CD36. También se evaluaron controles de anticuerpos emparejados de isotipo. Las células fueron fijadas en paraformaldehído al 1% de solución salina / tamponada con fosfato y se analizaron usando el citómetro de flujo Epics Elite (Beckman Coulter). Los datos fueron analizados utilizando el software FlowJo (TreeStar) El aislamiento y purificación de GPI de P. falciparum sin proteínas pf GPI se aisló y purificó por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) como se describe en otro lugar [16. 17] (véase también los métodos complementarios en el apéndice) factor de necrosis tumoral (TNF) ensayos PBMCs humanos (concentración, 5 × 10 5 células / pocillo) o macrófagos peritoneales tioglicolato-suscitó murinos (concentración, 2 × 10 5 células / pocillo) fueron tratadas con rosiglitazona o con DMSO como control, con o sin la adición de pf purificado por HPLC GPI (concentración, 200 nmol / L por ml). Después de la incubación durante 24 horas a 37 ° C, se recogieron los sobrenadantes y se ensayaron para TNF, usando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas ensayos de transducción de señal de tioglicolato-suscitó macrófagos peritoneales murinos fueron pretratados con rosiglitazona durante 24 h y se estimularon con pf GPI durante varios periodos. Se recogieron lisados ​​celulares, separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 12%, y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno. Las transferencias se sondearon con anticuerpos que reconocen, c-Jun quinasa total y phosphospecific quinasa extracelular regulada por señal media (ERK1 / 2) N-terminal (JNK), p38, y α quinasa I? B (I? B?), Se incubaron con la peroxidasa de rábano picante apropiada conjugada anticuerpo secundario, y desarrollado utilizando un sistema basado en electroquimioluminiscencia [17] la supervivencia murino y los estudios de citoquinas séricas Todos los experimentos con animales fueron revisados ​​y aprobados por el comité de la utilización de animales de la Universidad de Toronto y se realizaron según las directrices de la ética animal de la Universidad. Machos C57BL / 6 ratones (Charles River Laboratories) con edades de 8-12 semanas se utilizaron en la mayoría de los experimentos. CD36 - / - C57BL / 6 ratones fueron criados en el animalario de la Universidad de Toronto. Los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos con un ciclo de luz de 12 h. Una semana antes de la infección o 1, 3, o 5 días después de la infección, los ratones fueron alimentados ad libitum una dieta en polvo o polvo de Chow normal que contiene 50 mg / kg de rosiglitazona en formato en polvo. Para cada ratón, la infección se inició mediante inyección intraperitoneal de 1 × 10 6 eritrocitos parasitados recién aisladas con PBA o PccAS. Los ratones en el grupo de rosiglitazona continuó recibiendo el medicamento para el resto del experimento. El curso de la infección se controló diariamente durante 18 o 21 días a través de Giemsa-manchado frotis de sangre delgada para determinar el nivel de parasitemia En algunos experimentos, los ratones se sacrificaron el día 3, 5, o 7, y la sangre periférica se recogió por punción cardiaca. El suero se almacenó a -80 ° C y más tarde se analizó para determinar los niveles de TNF y factor de crecimiento transformante β (TGF-beta) por un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (RD Systems) Análisis estadístico Todos los experimentos in vitro se realizaron por duplicado o triplicado y se repitieron al menos 3 veces. Los datos son valores medios (± desviación estándar), a menos que se indique lo contrario. La significación estadística, que se define como un valor de p de la prueba de suma de rangos, dependiendo de si los datos se distribuyen normalmente. La normalidad se evaluó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. estudios de supervivencia para las infecciones de PbA se realizaron utilizando 5 ratones por grupo y se repitieron 3 veces. estudios de supervivencia para PccAS se realizaron utilizando 6-10 ratones por grupo y se repitieron una vez. La significación estadística se determinó mediante una prueba de log-rank. cursos de tiempo de parasitemia se analizaron mediante análisis de 2 vías de la varianza con una prueba de Bonferroni post hoc. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism resultados Rosiglitazona hasta regula CD36, aumenta la fagocitosis de P. falciparum - Parasitized eritrocitos, e inhibe PF inducido por TNF-GPI secreción Falta de control de la replicación de los parásitos en fase de sangre durante la infección aguda por Plasmodium y las respuestas inflamatoria mal regulada a la malaria se asocia con un pobre resultado clínico. La hipótesis de que las intervenciones terapéuticas para modificar estos componentes de la patogénesis de la malaria sería de beneficio clínico. la captación mediada por macrófagos de los eritrocitos parasitados, principalmente a través de la participación de receptores scavenger, tales como CD36, se ha demostrado que contribuyen al control de la infección aguda [6. 9 -11. 19. 20]. Para determinar si la rosiglitazona podría regular por incremento la expresión de superficie CD36 y la fagocitosis de eritrocitos parasitados-, humanos y macrófagos peritoneales murinos-tioglicolato provocada se trataron con concentraciones crecientes de rosiglitazona. Rosiglitazona indujo un aumento dependiente de la dosis en la superficie expresión de CD36 (Figura 1 A 1 B 1 1 D y E) que se asoció con un aumento dependiente de la dosis en la fagocitosis de los eritrocitos parasitados nonopsonized (Figura 1 C y 1 F). La fagocitosis se inhibió significativamente por el bloqueo anticuerpo monoclonal de CD36, lo que sugiere que es dependiente de CD36 Rosiglitazona hasta regula la expresión superficial de CD36 y CD36 aclaramiento mediado de Plasmodium falciparum - parasitized eritrocitos. Los macrófagos humanos y murinos tratados con rosiglitazona durante 48 h se evaluaron para la expresión de superficie CD36 (por citometría de flujo) y por su capacidad para fagocitar nonopsonized P. falciparum - parasitized eritrocitos. A y D intensidades de fluorescencia CD36 (IF) para macrófagos murinos (D) (A) humano y. Los datos de los macrófagos tratados con 100 mmol / L de la rosiglitazona se muestran en datos de color negro para los macrófagos tratados con control de vehículos se muestran en gris oscuro y los datos para los macrófagos teñidos con anticuerpo de control de isotipo se muestran en gris claro. B y E CD36 IF medias geométricas (GMFIs) para (E) macrófagos murinos humana (B) y. Aquí y en otros lugares, barras blancas indican el control de sulfóxido de dimetilo (DMSO [control del vehículo]), y las barras negras indican varias concentraciones rosiglitazona. macrófagos murinos (F) C y F La fagocitosis de los eritrocitos parasitados nonopsonized por humanos (C) y. barras rayadas captación por los macrófagos tratados previamente con 5μg / ml de anticuerpo anti-CD36 monoclonal. Los datos son de un experimento representativo realizado por triplicado. Todos los experimentos se repitieron al menos 3 veces. Para C * P = .02, P.004 para la comparación de las concentraciones de DMSO con rosiglitazona de 50 mmol / L y 100 mmol / l, respectivamente. Todas las comparaciones estadísticas se realizaron mediante análisis de varianza y prueba de Tukey-Kramer post hoc de 2 colas Para determinar si la rosiglitazona podría modular las respuestas inflamatorias de malaria inducida, PBMCs humanos y macrófagos peritoneales tioglicolato-suscitó murinos fueron incubadas con concentraciones crecientes de rosiglitazona y pf purificado por HPLC GPI [11. 16. 17]. La rosiglitazona inhibió pf GPI inducida por la secreción de TNF por las células humanas (Figura 2 A) y células murinas (figura 2 B) de una manera dependiente de la dosis La rosiglitazona inhibe glicosilfosfatidilinositol Plasmodium falciparum (PF GPI) de señalización inducida y la producción de factor de necrosis tumoral (TNF). macrófagos A y células mononucleares de sangre periférica B Humanos (A) y (B) murinos fueron tratados con rosiglitazona (concentración, 10-100 mmol / L; barras negras) o dimetilsulfóxido (DMSO [control del vehículo]; barras blancas) más pf GPI (200 nmol / L por ml). los niveles de TNF se evaluaron mediante el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas 24 h después del tratamiento. Los experimentos se repitieron al menos 3 veces con resultados similares. Los datos mostrados son de un experimento representativo. Para A * P -, ausente pf GPI promueve la inducción de citoquinas a través de la activación de TLR2 dependiente de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) y NF-kB vías de señalización [11. 16. 17]. Para investigar los mecanismos implicados en la inhibición mediada por rosiglitazona de la respuesta inflamatoria estimulada por GPI pf, se examinaron los efectos de la rosiglitazona en las vías de señalización inducidas por GPI pf. pf GPI induce la fosforilación de JNK, ERK1 / 2, y p38, y que promueven la degradación de I? B?, un paso precursor a la activación de NF-kappa B (figura 2) [16. 17]. El tratamiento con rosiglitazona resultó en una inhibición dependiente de la dosis de la fosforilación de JNK, ERK1 / 2, y p38 (Figura 2 C). Además, rosiglitazona inhibió pf inducida por la degradación de I? B? GPI (Figura 2 D). Estas observaciones indican que la rosiglitazona reduce la señalización inducida por GPI pf y producción de citoquinas proinflamatorias in vitro Rosiglitazona modula la respuesta inmune innata a la malaria y mejora el resultado Infección En Vivo Para extender el análisis a la configuración in vivo, hemos examinado la eficacia de la rosiglitazona en la modulación de las respuestas innatas en modelos murinos de malaria. Debido a que no existe un modelo experimental murino única de la malaria existe que abarca todos los aspectos de la enfermedad clínica debido a la infección por P. falciparum en los seres humanos, se investigó la eficacia de la rosiglitazona en 2 modelos murinos complementarias. Para examinar la capacidad de la rosiglitazona para modular la respuesta inmunopatológica en el huésped, se utilizó el modelo de PBA de la malaria cerebral experimental [8]. Para examinar la capacidad del fármaco para mejorar la eliminación del parásito y reducir la carga parasitaria, se utilizó el modelo de PccAS hiperparasitemia [6. 8] La rosiglitazona modifica las respuestas inflamatorias y mejora la supervivencia en un modelo experimental de la malaria cerebral similares a P. falciparum en los seres humanos, los ratones PBA-susceptible (por ejemplo, cepa C57BL / 6) desarrollar síntomas de malaria cerebral durante la infección, incluyendo una encefalopatía citoquina asociada, síntomas neurológicos y acidosis que culmina en un desenlace fatal [8]. malaria cerebral asociada a PBA se caracteriza por una respuesta de citoquinas desequilibrada a la infección, con niveles elevados de citoquinas proinflamatorias y la inducción inadecuada de citoquinas reguladoras [6. 8]. Se utilizó este modelo experimental para investigar si la rosiglitazona modula favorablemente el anfitrión de la respuesta inflamatoria a la infección y confiere protección contra la malaria cerebral Control y C57BL / 6 ratones tratados con rosiglitazona fueron infectados con 1 × 10 6 eritrocitos parasitados-PBA y evaluados una vez al día para los niveles de parasitemia y de TNF en suero y TGF-beta y dos veces al día durante la morbilidad y la supervivencia (figura 3). Todos los ratones de control desarrollaron síntomas neurológicos característicos de la malaria cerebral, incluyendo parálisis de las extremidades, trastorno del movimiento, ataxia, convulsiones y coma, y ​​sucumbieron a la infección de 6-10 días después de la aparición de la infección. En contraste, los ratones tratados con rosiglitazona tuvieron una mayor tasa de supervivencia (43% frente a 0%; p = 0,007) (Figura 3 A). Los ratones tratados con rosiglitazona que sucumbieron a la infección también tenían signos neurológicos. El nivel de parasitemia no fue diferente entre el control y los ratones tratados con rosiglitazona (Figura 3 B), consistente con estudios previos en los que dysregulated respuestas de citoquinas, en lugar de la parasitemia en sí, se mostró a ser responsable de la mortalidad durante la fase aguda de la infección PBA [ 8. 30] La rosiglitazona mejora la supervivencia y modula la inflamación en un modelo murino de malaria cerebral. C57BL / 6 ratones que recibieron comida con o sin rosiglitazona (concentración, 50 mg por kg de pienso) se infectaron con eritrocitos parasitados-ANKA cepa 1 × 10 6 Plasmodium berghei mediante inyección intraperitoneal. Un Supervivencia, evaluado dos veces al día (15 ratones por grupo; prueba de la suma de la broma Durante la infección aguda, las primeras respuestas proinflamatorias, en particular la liberación de IFN-γ y TNF, están obligados a facilitarle la eliminación del parásito, pero tienen que ser equilibrada, en parte por las citoquinas inmunorreguladoras / anti-inflamatorios como el TGF-β e IL-10, a limitar la respuesta inmunopatológica anfitrión mediada [30 -35]. Para evaluar el efecto de la rosiglitazona en las respuestas inflamatorias inducidas por PBA, se examinaron los niveles séricos de TNF y TGF-β en los días 3, 5 y 7 de la infección. Los niveles circulantes de TNF en ratones tratados con rosiglitazona fueron significativamente menores que los de los ratones de control (Figura 3 C). Además, la relación de TNF a TGF-β para los ratones tratados con rosiglitazona fue significativamente inferior a la de los ratones de control en todos los días evaluados (figura 3 D). Tomados en conjunto, estos datos demuestran que el tratamiento con rosiglitazona altera las respuestas inflamatorias huésped a la infección PBA y mejoró la supervivencia en un modelo experimental in vivo de la malaria cerebral Para determinar en qué momento durante el curso de la rosiglitazona infección todavía puede conferir una mayor supervivencia, se examinaron ratones C57BL / 6 infectados con PBA y que el tratamiento iniciado el 1 semana antes de la infección o de 1, 3 o 5 días después de la infección (figura 4) . Como en el experimento anterior, todos los ratones control murieron de infección (murieron todos P = 0,041). Estos datos indican que la administración terapéutica de rosiglitazona tan tarde como el día 5 después de la infección aumentaba la tasa de supervivencia en un modelo experimental de la malaria cerebral La administración terapéutica de rosiglitazona tan tarde sólo 5 días después de la infección aumenta la supervivencia. C57BL / 6 ratones recibieron comida más rosiglitazona (concentración, 50 mg por kg de pienso; líneas grises) 1 semana antes de la infección (A) o 1 día (B) 3 días (C) o 5 días (D) después de la infección. Los ratones de control (líneas negras) no recibieron adiciones a su Chow. Los ratones fueron infectados con eritrocitos parasitados-ANKA cepa 1 × 10 6 Plasmodium berghei a través de inyección intraperitoneal. La supervivencia se evaluó diariamente. P.003 (C) y P = 0,016 (D) (n = 10 ratones por grupo). Todas las comparaciones estadísticas se realizaron mediante la prueba de log-rank La rosiglitazona mejora la eliminación del parásito de manera CD36-dependiente, en un modelo de malaria hiperparasitemia La fase aguda de la infección PccAS se caracteriza por hiperparasitemia que resulta en la muerte si la replicación del parásito no está contenida adecuadamente [6. 8]. Los macrófagos han demostrado ser células efectoras clave en el control de hiperparasitemia [9. 10]. el control temprano de la replicación del parásito depende de mecanismos innatos que implican receptores scavenger, incluyendo CD36, y es en gran medida independiente de opsoninas, incluyendo IgG específica del parásito y componentes del complemento [9 -11. 36 -38] Se utilizó el modelo PccAS de la malaria para examinar la eficacia de la rosiglitazona en la facilitación de la liquidación de los eritrocitos parasitados y reducir la carga de parásitos in vivo. Control y C57BL / 6 ratones tratados con rosiglitazona fueron infectados con 1 × 10 6 eritrocitos parasitados-PccAS (figura 5. cuales sólo aparece en la edición electrónica de la revista). Parasitemia, la morbilidad y la mortalidad se evaluaron todos los días, a partir del día 5 de la infección. ratones C57BL / 6 son naturalmente resistentes a la infección PccAS [6. 8], y, en consecuencia, las tasas de supervivencia no difirieron significativamente entre los ratones tratados con rosiglitazona y ratones de control (90% y 80%, respectivamente). Sin embargo, la rosiglitazona tuvo un efecto significativo sobre la parasitemia (P.001, por la prueba de Bonferroni post hoc) La rosiglitazona reduce la parasitemia en un modelo murino de hiperparasitemia en presencia, pero no la ausencia de CD36. ratones C57BL / 6 (A y B) o Cd36 - / - C57BL / 6 ratones (C y D) que recibieron comida con o sin rosiglitazona (concentración, / kg de pienso 50 mg) se infectaron con 1 × 10 6 Plasmodium chabaudi chabaudi cepa eritrocitos parasitados a través de AS-inyección intraperitoneal. A y C de la supervivencia se evaluó al día (n = 10 ratones C57BL / 6 ratones por grupo, y n = 6 Cd36 - / - C57BL / 6 ratones por grupo). Análisis mediante la prueba de log-rank no reveló diferencias significativas entre los ratones de control y ratones tratados con rosiglitazona. B y el nivel de parasitemia D se evaluó diariamente comenzando en el día 5 después de la infección (n = 10 ratones C57BL / 6 ratones por grupo, y n = 6 Cd36 - / - C57BL / 6 ratones por grupo). Para los ratones de tipo salvaje (B) el nivel de parasitemia entre los animales tratados con rosiglitazona fue significativamente menor que entre los ratones de control en los días 11 y 12 (* P = .03 para el día 11 y P.001 para el día 12, por 2 - way análisis de la varianza con un post-test de Bonferroni). Sin embargo, para Cd36 - / - ratones (D) el nivel de parasitemia no varió significativamente entre los ratones tratados con rosiglitazona y control de ratones Para determinar si la reducción inducida por rosiglitazona en la carga parasitaria observada en el modelo PccAS era dependiente de CD36, se infectaron control y tratados con rosiglitazona Cd36 - / - ratones (figura 5, que sólo aparece en la edición electrónica de la revista). Aunque estos ratones están en la C57BL / 6 antecedentes genéticos resistente, su incapacidad para producir CD36 previamente se ha demostrado que sean más susceptibles a la infección PccAS [11]. La tasa de mortalidad (50% para el grupo control y el grupo de rosiglitazona) y el nivel de parasitemia no difirieron significativamente entre los ratones de control y ratones tratados con rosiglitazona. En resumen, el tratamiento con rosiglitazona, en ausencia de CD36 no disminuir la carga de parásitos o mejorar la tasa de supervivencia de los ratones infectados por PccAS, lo que sugiere que CD36 debe estar presente para rosiglitazona a tener un efecto beneficioso Discusión Acoger las respuestas inmunopatológicas son importantes contribuyentes a las consecuencias graves y mortales en una serie de síndromes de enfermedades infecciosas potencialmente mortales, como el paludismo cerebral [3. 39]. A pesar de esto, algunos agentes terapéuticos se han desarrollado para modular las respuestas inmunes del huésped a la infección perjudicial. Aquí, mostramos que la rosiglitazona, un agonista PPAR aprobado por la FDA, el aumento de la fagocitosis de los macrófagos de parasitada eritrocitos in vitro y la reducción del nivel de parasitemia in vivo, modifica las respuestas inflamatorias innatas a la malaria in vitro e in vivo, y confirieron mejoró la supervivencia en un modelo experimental de malaria cerebral. En los experimentos que simulan las condiciones clínicas, la rosiglitazona mejora la supervivencia, incluso cuando se inicia hasta 5 días después de la infección, en un momento en que los síntomas de la malaria cerebral se están manifestando. Esto sugiere que la rosiglitazona puede ser útil para el tratamiento de infecciones por Plasmodium establecidos Para los seres humanos con infección por Plasmodium y en modelos murinos de malaria, la supervivencia está vinculada a la capacidad del huésped para generar una respuesta inflamatoria regulada y controlar la replicación del parásito durante la etapa aguda de la infección [6]. respuestas inflamatorias excesivas o disregulados a la infección han sido implicados en los procesos inmunopatológicos consistentemente asociados a la malaria [6. 31. 34. 35]. En este estudio, hemos demostrado que la rosiglitazona inhibió la señalización inducida PF-GPI y la secreción de TNF in vitro y las respuestas inflamatorias innatas moduladas, en particular el equilibrio entre los niveles de citoquinas pro-y inmunorreguladores, en ratones infectados con PBA. pf GPI se piensa que es un mediador proinflamatorio importante, y CD36 coopera con TLR2 en reconocer e iniciar respuestas a ella. El síndrome de malaria cerebral observada en la infección PBA se produce incluso en ausencia de CD36 [40], y por lo tanto, las acciones beneficiosas de la rosiglitazona observada en este modelo puede ser independiente de sus efectos sobre la expresión de CD36. En lugar de ello, la rosiglitazona puede ejercer la actividad anti-inflamatoria a través de regulación de la transcripción directa, por la inhibición de la actividad de factores de transcripción tales como AP-1 y NF-kappa B [25 -28] Los estudios en seres humanos y ratones también apoyan un papel importante para los fagocitos mononucleares en el aclaramiento de parásitos en etapa de sangre y principios del control de la carga de parásitos durante la infección aguda [6. 9 -11. 19 -21]. Aquí, nos demuestran que la rosiglitazona hasta reguladas expresión de macrófagos CD36 y CD36 mediada por la captación de P. falciparum - parasitized eritrocitos in vitro. Usando el modelo in vivo de hiperparasitemia inducida por PccAS, se demuestra que el tratamiento con rosiglitazona como resultado una disminución de CD36-dependiente en la carga parasitaria. En ratones con CD36 suficiencia, rosiglitazona redujo significativamente el nivel de parasitemia. En particular, la rosiglitazona no logró disminuir el nivel de parasitemia cuando se administró a ratones CD36-deficiente, lo que sugiere que los efectos de la rosiglitazona en parasitemia son CD36-dependiente y pueden ser atribuibles a un aumento del aclaramiento de CD36 mediada. En el modelo de PBA de la malaria cerebral experimental, rosiglitazona no afectó el nivel de parasitemia. Sin embargo, a diferencia de P. falciparum y P. chaubaudi no está claro si P. berghei - parasitized eritrocitos se borran por fagocitosis mediada por CD36 [11. 40] La contribución de CD36 a Plasmodium patogénesis o, por el contrario, a la protección durante la infección por Plasmodium sigue sin determinarse. CD36 se identificó inicialmente como un receptor para el secuestro de los eritrocitos parasitados, lo que lleva a la suposición de que contribuye a la patogénesis de la malaria cerebral; Sin embargo, varias líneas de evidencia parecen desafiar esta premisa [11. 9 -21. 40 -43]. Debido a que la expresión de CD36 en el cerebro es mínima o ausente, cytoadherence directa de los eritrocitos parasitados a endoteliales CD36 es poco probable que cuenta para el secuestro cerebral, aunque se ha propuesto que la adhesión puede ser mediada a través de puente a través de plaquetas CD36 [44. 45]. CD36 se expresa altamente en el endotelio microvascular de la piel y el tejido adiposo y puede dirigir los parásitos a estos sitios no vitales y lejos de la microvasculatura cerebral [20. 21]. Esta hipótesis está apoyada por estudios que demuestran que un número significativamente mayor frecuencia de eritrocitos parasitados unión a CD36 ocurre en los casos de enfermedad no grave, por los informes que muestran que la protección contra la malaria cerebral observada en individuos con ovalocitosis del sudeste asiático se asocia con aumento de la adhesión de los eritrocitos ovalocytic parasitados a CD36 [41. 42], y por los datos de población que vinculan la deficiencia de CD36 con un aumento de la susceptibilidad a la malaria cerebral [43]. Por el contrario, los informes recientes que examinan otros trastornos asociados con eritrocitos protección contra la enfermedad severa, incluyendo células falciformes y la talasemia, han reportado disminución de la adhesión CD36 mediada alterado debido a PfEMP-1 de expresión en los eritrocitos parasitados [46]. Sin embargo, estos eran los estudios in vitro llevados a cabo en ausencia de suero, y la evidencia directa in vivo de infecciones humanas es en la actualidad carecen. Aunque la contribución precisa de CD36 a la protección o patogénesis requerirá investigación adicional, nuestra in vitro e in vivo en apoyo de una función beneficiosa para los agonistas PPAR en la infección de malaria aguda, que es al menos parcialmente mediadas por la modulación de la respuesta inmune innata, incluidas las relativas CD36 macrófagos La capacidad de rosiglitazona para modificar el secuestro de eritrocitos parasitados en el endotelio es una preocupación potencial. Aunque los agonistas de PPAR se ha demostrado que un máximo de regular tanto CD36 y ICAM-1 de expresión, estos agonistas tenían efectos mínimos sobre la expresión de receptores de secuestro en las células endoteliales y no hasta de regular la adhesión celular endotelial de los eritrocitos parasitados [47] Notas al pie referencias Organización Mundial de la Salud .